Human Abzymes with Amylolytic Activity

Amylolytic abzymes are a new type of catalytically active human antibodies that have been found recently. Various immunoglobulins from the sera of patients with autoimmune diseases and human milk were found to possess amylolytic activity, which is expressed in their ability to hydrolyze ƒ¿-(1,4)D-glucosyl linkages of maltooligosaccharides, starch, glycogen, and several artificial substrates. Pure IgM fractions isolated from several tens of analyzed patients with clinically definite diagnoses of multiple sclerosis (MS) and systemic lupus erythematosus (SLE) had approximately three orders of magnitude higher specific amylolytic activity than those for healthy donors. Average values for the specific amylolytic activity of IgGs and sIgAs from human milk were five times less than of IgMs from autoimmune patients. Strict criteria were used to prove that the amylolytic activity of abzymes was their intrinsic property and was not due to any enzyme contamination. Fab fragments derived from IgM and IgG fractions of human abzymes displayed the same level of amylolytic activity. Values for Michaelis constants KM in the abzyme-mediated hydrolysis of different ƒ¿-Dmaltooligosaccharides and ƒ¿-D-maltooligosaccharides with chromogenic and fluorescent label on reducing end were in the range of 1-2 to 0.01 mM. Abzyme fractions from different donors demonstrated catalytic heterogeneity in Michaelis-Menten parameters and different modes of action in the hydrolysis of natural and artificial substrates. One part of amylolytic immunoglobulins exhibited exo-amylase action when others have also ƒ¿-glucosidase activity yielding glucose and capable of cleaving pnitrophenyl ƒ¿-D-glucopyranoside. Enzymatic properties of all tested amylolytic abzymes distinguished from those of putative human ƒ¿-amylases. None of the IgM, IgG, and sIgA samples investigated showed transglycosylating ability. A. Introduction Antibodies (Abs) possessing enzymatic activities 要 約 澱粉分解活性をもつアブザイムが酵素活性をもつヒト抗体 の新しいタイプとして最近発見された。自 己免疫疾患患者の血 清やヒトの母乳にはマル トースオリゴサッカライ ド、澱 粉、グ リコーゲンや人工基質のα-(1,4)-グルコシル結合を加水分解する 活性をもつさまざまな免疫グロブリンがあることが知 られてい た。臨 床的に多発性硬化症や全身性エリマ トーデスであると診 断された数十人の患者のIgM分 画は健常者のものと比較 して澱 粉分解の比活1生が約千倍高い。ヒ ト母乳のIgG, IgAの 活性の平 均値は比活性にして自己免疫疾患患者のIgMの 五分の一以下で あった。ア ブザイムの活性は抗体そのものがもつ性質であって 酵素の混入によるものではないことを証明するための厳密な実 験がおこなわれてきた。ア ブザイムのIgMとIgG分 画をFabフ ラグメントにしても同程度の活性を示 した。還 元末端に発色団 や蛍光標識をもつさまざまなマル トースオリゴサッカライ ドに 対するアブザイムによる分解活性のKMは1~2mMか ら0.01mM であった。異 なる ドナーからのアブザイムはミカエリスメンテ ン値の不均一性を示 し天然基質や人工基質の分解様式にも差異 がみられた。あ るものはエキソ型アミラーゼ活性を示し、ま た あるものはグルコースを遊離するα-グルコシダーゼ活性を示し p-ニ トロフェニル-α-D-グルコピラノサイドを分解できた。調 べ られたすべての澱粉分解活性をもつアブザイムの酵素的性質は ヒトの α-アミラーゼと異なっていた。IgM, IgG, sIgAは いず れもトランスグリコシレーション活性を示 さなかった。 A. はじめに 酵素活性をもつ抗体(ア ブザイム)が存在することはよく知 c2004 FCCA (Forum: Carbohydrates Coming of Age) 17 Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 16 No. 87 (January 2004) pp. 17-31 (abzymes) are becoming a well-known phenomenon. The hypothesis of Jencks, that monoclonal antibodies directed against an analog of transition state of an enzymatic reaction can exhibit a catalytic function (1, 2), forms the basis for understanding abzyme production. Thus, raising monoclonal or polyclonal antibodies to chemically synthesized haptens, which imitate transition states, show the presence of catalytic activity. With this approach, more than a hundred types of catalytic, mainly hydrolytic, activities were obtained (3, 4). The method of immune response on transition state was also used for the creation of nonhydrolytic antibodies capable of catalyzing cationic cyclization (5), acyl-transfer reaction (6) and some others (7). Antibodiesenzymes were named 'abzymes' as an abbreviation between AntiBody and enZYME. Abzymes (Abzs) obtained by the abovementioned method have extremely high catalytic efficiency: rate accelerations for catalytic antibody-mediated transformations are up to 106 higher than for un-catalyzed chemical reactions (8). In some cases, Abzs show higher stereospecificity than putative enzymes. This approach, i.e. immunization on various haptens, also enables obtaining new enzymatic activities, which do not have analogs in traditional enzymology (9). Another successful method, the induction of anti-idiotypic antibodies, has been recently developed for the production of catalytically active antibodies. It is based on the production of secondary antibodies on antibodies initially elicited against the active center of the enzyme (10). Several years ago, a phenomenon of in vivo generation of catalytic antibodies in the sera of humans was discovered. The first record on human catalytic IgGs isolated from the blood of patients with such autoimmune diseases as asthma and thyroiditis, reported their ability to hydrolyze peptides and proteins (11, 12). It was the first time that human catalytic autoantibodies were also called abzymes. Further, all antibodies exhibiting enzymatic properties were given this name. Nuclear acid nicking activity was next observed at human autoantibodies. Thus, the IgG fractions isolated from the blood of patients suffering from systemic lupus erythematosus (SLE) were found to manifest DNA-hydrolytic activity (13, 14). Further findings revealed that RNA-cleaving activity of immunoglobulins G and M conelates with a number of autoimmune pathologies, like multiple sclerosis (MS), SLE, Hashimoto's thyroiditis, polyarthritis, and rheumatoid arthritis (15-17). Noteworthy, healthy donors and patients suffering from influenza, pneumonia and tuberculosis do not exhibit essential level of RNAand DNA-hydrolase activities of sera antibodies. However, both activities were found in IgG and sIgA fractions from human milk of healthy mothers (19). The last catalytic activity that was detected in human autoantibodies was amylolytic. It appeared that human abzymes cleave off linkages both in different ƒ¿-D-maltooligosaccharides and glycogen or starch (20). Below, we will discuss the spreadられた現象である。酵 素反応の遷移状態の基質アナログに対す るモノクローナル抗体は触媒活性を示しうるというJencksの 仮 説はアブザイムの生成を理解する根拠となっている。す なわち 遷移状態を真似て化学的に合成されたハプテンに対 してモノク ローナルおよびポリクローナル抗体を作成すると酵素活性がみ られる。こ の方法により百種類以上の触媒活性(主 に加水分解活 性)が得 られた(3、 4)。遷 移状態に対する免疫応答の手法は加水 分解活性以外の活性、ポ リエンの環化(5)、ア シル基転移(6)、 その他(7)、を もつ抗体の作成にも用いられた。酵 素活性をもつ 酵素は抗体AntiBodyと 酵素enZYMEの 両方をあわせた略とし てアブザイムabzymes (Abzs)と 名付けられた。上 記の方法で得 られたアブザイムは非常に高い酵素活性をもち化学反応の速度 を106倍 にも高める(8)。い くつかの例ではアブザイム は酵素 よりも高い立体特異性を示す。さ まざまなハプテンによる免疫 を行 うどいう手法により古典的酵素学でアナログがみつかって いない新しい酵素活性を得ることも可能である(9)。 酵素活性をもつ抗体を作成するためのよい方法 として抗 イ ディオタイプ抗体を作成するという方法が最近開発 された。こ れは酵素の触媒部位に対する抗体に対する二次抗体を作成する ものである(10)。 数年前にin vivoで も触媒活性をもつ抗体が生成している現 象がヒト血清において発見された。最 初の報告は喘息や甲状腺 炎のような自己免疫疾患患者の血液から分離されたIgGが ペプ チドやタンパク質を加水分解する活性をもつ というものであっ た(11、 12)。ま たこれは酵素活性をもつヒトの自己抗体もアブザ イムと呼ばれた最初でもあった。酵 素活性をもつすべての抗体 にこの名称が与えられるようになった。次 に核酸にニックを入 れる活性をもつものがヒト自己抗体に見つかった。全 身性エリ マ トーデス(SLE)患 者の血液のIgG分 画に顕著なDNA分 解活 性があったのである(13、 14)。引 き続いてIgG, IgMのRNA分 解活性が さまざまな自己免疫疾患、多 発性硬化症(MS), SLE, ハシモ ト甲状腺炎、リ ウマチ性関節炎(15-17)、と 関連すること が明らかになった。特 筆すべ きことにインフルエ ンザ、肺 炎、 結核の患者と健常者のどちらの血清 にもRNAやDNAの 分解 活性はないのに、健 康 な母親の母乳のIgG, sIgAに は両方の分 解活性が発見された(19)。 ヒト自己抗体の触媒活性として最後に見つかったものが澱 粉分解活性である。ヒ トのアブザイムには異なるα-マル トース オリゴサッカライ ドとグリコーゲンや澱粉を分解する活性が見 c2004 FCCA (Forum: Carbohydrates Coming of Age) 18 Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 16 No. 87 (January 2004) pp. 17-31 ing of human amylolytic abzymes and the specificity of their action. B. Amylolytic Abzymes: Where Were They Found? All human antibodies with amylolytic activity are able to hydrolyze ƒ¿1,4-glucosidic bonds both in polymeric substrates (starch, glycogen, amylose) and maltooligosaccharides with a degree of polymerization (d.p.) greater than 3. In the latter case, amylolytic Abzs yield maltose, maltotriose and maltotetraose as main products of the hydrolytic reactions similarly to ƒ¿-amylases (E.C.3.2.1.1) from various sources (21, 22). Like traditional exo-amylases, fractions of human Abzs with amylolytic activity hydrolyze also well-known, commercially available substrate, 4-nitrophenyl 4,6-O-ethylidene-ƒ¿-D-maltoheptaoside (EPS), as well as p-nitrophenyl (PNP) ƒ¿-D-maltooligosaccharides or 4-methylumbelliferyl (MeUmb) ƒ¿-D-maltooligosaccharides (Fig. 1) (23, 24). A part of the tested samples showed ƒ¿-D-glucosidase (E.C.3.2.1.20) action and as such, were able to hydrolyze PNP ƒ¿-D-glucoside, maltose and maltotriose. Obviously, such amylolytic abzymes produce glucose along with short maltooligosaccharides in the hydrolysis of polymeric and oligomeric substrates. It is glucose that is a final product of the completed hydrolysis catalyzed by human amylolytic Abzs of such mode of action (Fig. 1). Initially, amylolytic activity was shown in the IgG preparations isolated from the blood of pregnant women and several cancer patients (20). Then, similarly to nuclear acid hydrolyzing activity, amylolytic function was found in IgG and sIgA fractions of human milk (23, 24). Specific amylolytic activities* い だ され た(20)。以 下 に ヒ トの澱 粉 分 解 活 性 を もつ ア ブザ イ ム の分 布 と反 応 の 特 異性 を述 べ た い。 B. 澱 粉 分 解 活性 を もつ ア ブザ イ ム:ど こで 発 見 され た か? す べ て の澱 粉 分 解 活性 を もつ ヒ ト抗 体 は多 糖 類(澱 粉、グ リ コ ーゲ ン、ア ミロー ス)お よび重 合 度3以 上 の マ ル トー ス オ リゴ サ ッカ ライ ドの α1,4-グ リコ シ ド結 合 を加 水分 解 す る。後 者 の場 合 ア ブザ イ ム に よ る主 な生 成物 は マ ル トー ス、マ ル ト トリオ ー ス、マ ル トテ トラ オ ース で あ り、こ の点 は さ ま ざ まな 由来 の αア ミラー ゼ(E.C. 3.2.1.1)に よる生 成 物 と同様 で あ る(21、 22)。エ キ ソ ー ア ミ ラ ーゼ の 場 合 の よ う に ヒ トア ブザ イ ム は よ く知 られ た市販 の基 質、4-ニ トロ フェニ ル4,6-O-エ チ リデ ンα-D-マル トヘ プ タサ イ ド(EPS)、 pニ トロ フ ェニ ル-(PNP)α-D-マ ル トー ス オ リ ゴサ ッカ ラ イ ド、4-メ チ ル ウ ンベ リフ ェル(MeUmb)α-D-マ ル ト オ リ ゴサ ッカラ イ ドも分 解 す る(図1)(23、 24)。一 部 の アブ ザ イ ム は α-D-グ リ コ シ ダー ゼ(E.C.3.2.1.20)活 性 を もちPNP α-D-グ ル コサ イ ド、マ ル トー ス、マ ル ト トリオ ー ス を分 解 す る。明 らか に、そ の よ う な澱 粉 分 解 活性 を もつ ア ブ ザ イ ム の生 成 物 はマ ル トー ス オ リ ゴサ ッ カ ラ イ ドの他 に グル コ ー ス を含 ん で い る。そ う した ア ブザ イ ムの 反 応 が 完 全 に進行 した場 合 の最 終 産 物 は グ ル コ ー スで あ る。 最 初 に澱 粉 分 解 活性 は妊娠 女性 や が ん患 者 の血 液 のIgG分 画 にみ い だ され た(20)。そ して核 酸 ニ ッキ ン グ活性 と同様 に、 ヒ トの 母 乳 のIgG, sIgA分 画 に見 つ か っ た(23、 24)。調 べ られ た Exo-amylase-like Abz action